Reaksi rantai polymerase dapat dilakukan lebih dari satu daerah untuk di copy terus-menerus dengan menambahkan secara sederhana lebih dari satu kali reaksi campuran yang complete. Untuk reaksi yang multiplex untuk bekerja memerlukan pasangan yang cocok. Suhu sangat mempengaruhi dalam reaksi ini untuk menjaga formasi yang baik dari DNA. Tambahan beberapa reaksi PCR multiplex yang baru akan meningkatkan secara exponent keinteraksiannya.
Beberapa aplikasi PCR yang baru memerlukan beberapa tingkatan untuk keoptimalannya di dalam komponen-komponen reagennya atau dalam kondisi siklus suhu. Keoptimalan Multipex PCR lebih banyak tantangan daripada reaksi singleplex karena memerlukan kondisi yang lebih simultan.
Variabel-variabel harus diperiksa ketika mencoba untuk mendapatkan hasil yang optimal dari multiplex PCR termasuk reagen-reagen dlm kondisi suhu yang baik.Rangkaian-rangkaian primer dan konsentrasi magnesium biasanya sangat menentukan hasil dari multiplex PCR. Perpanjangan waktu selama siklus suhu biasanya meningkatkan daei raeksi multiplex PCR dalam memberikan waktu polymerase untuk mengcopy lengkap seluruh target DNA.
PCR multiplex memerlukan STR (Short Tandem Repeat) untuk membetulkan reaksi agar mendapatkan pemisahan ukuran yang baik antara locus dengan celup fluorosencenya. PCR multiplex harus menghasilkan amplifikasi tetap dengan keseimbangan puncak yang baik sebaik locus yang memiliki amplifikasi spesifik dengan hasil yang non-spesifik. Akhirnya PCR multiplex memerlukan hasil maksimal non-template-dependent ‘+A’ ditambah untuk seluruh hasil PCR.
