PCR adalah proses enzimatik dimana suatu area spesifik dari DNA direplikasikan berulang-ulang untuk menghasilkan banyak kopi dari sekuen tertentu. ( Saiki et al. 1988, Reynolds et al. 1991 ). Pengkopian molekuler ini meliputi proses pemanasan dan pendinginan sampel dalam suatu siklus panas tertentu yang melebihi dari 30 siklus ( gambar 4.1 ). Dalam setiap periode siklus, sebuah kopi dari sekuen target DNA tersebut dihasilkan untuk setiap molekul yang mengandung sekuan target ( gambar 4.2 ). Keterbatasan dari produk ini ditegaskan dengan oligonukleotida primer yang melengkapi buntut 3’- dari sekuen tersebut.
Figure 4.1
Thermal cycling temperature profile for PCR. Thermal cycling typically involves three different temperatures that are repeated over and over again 25--35 times. At 95 degree celcius, the DNA strands separated or denature. At 60 degree C, primers bind or 'anneal' to the DNA template and target region on to the amplified. At 72 degree C, the DNA polimerase extends the primers by copying the target region using the deoxynucliotide tripospate building blocks. The entree PCR process is about3 hours in duration with each cycle taking 5 minutes on conventional thermal cyclers: 1 minute each at 94 degree C, 60 degree C and 72 degree C and about 2 minutes ramping between the three temperatures
Figure 4.2
DNA AMplification process with the polimerase chain reaction. in each cycle the two DNA template strands are firsst separated (denatured) by heat. The sample then cooled to an appropriate temperature to bind (anneal) the oligonucleotide primers. Finally the temperature of the sample is raised to the optimal temperatur for the DNA polymerase and its extends the primers to produce a copy of each DNA template strand. For each cycle, the number of DNA molecules (with sequence between the two PCR primers) double.
Secara teoritis setelah 30 siklus, telah tercipta kopi dari area target cetakan DNA sebanyak satu milyar ( tabel 4.1 ). Produk PCR ini, yang terkadang disebut sebagai ‘amplicon’, dalam jumlah yang cukup dapat diukur dengan mudah menggunakan berbagai teknik yang akan dibahas lebih lanjut dalam bab teknologi.
PCR umumnya dilakukan dengan jumlah sampel sebanyak 5 – 100 µL. Dengan jumlah yang sangat rendah itu, penguapan dapat menjadi masalah dan akurasi dari pengambilan sampel dapat menjadi tantangan. Di sisi lain, volume sampel yang lebih besar mengarahkan pada masalah keseimbangan panas bagi reaksi pencampuran karena dibutuhkan waktu yang lebih lama bagi perubahan suhu eksternal agar dapat ditransmisikan ke pusat sampel ( bagi sampel yang lebih banyak dibandingkan dengan sampel yang sedikit ). Maka, dibutuhkan waktu yang lebih lama untuk setiap suhu, sehingga keseluruhan waktu siklus panas yang dibutuhkan juga memanjang. Sebagian besar protokol biologi molekuler untuk sampel PCR adalah antara 20 - 50 µL.
Sampel dipipetkan ke dalam berbagai tabung reaksi yang didesain untuk digunakan dalam siklus panas PCR. Tabung yang paling umum digunakan untuk sampel sebanyak 20 – 50 µL adalah tabung berukuran 0,2 mL dengan dinding tipis. Tabung – tabung ini dapat dibeli satuan, dengan atau tanpa tutup, atau juga dibeli berkelompok, yaitu 8 atau 12 tabung berderet dalam kolom. Pada lab yang lebih besar, dalam penjabaran DNA menggunakan PCR, secara rutin digunakan plat berisikan 96 atau 384 tempat.
PCR telah disederhanakan dalam beberapa tahun belakangan ini dengan adanya perangkat reagen yang memudahkan Laboratorium DNA forensik untuk menambahkan cetakan DNA ke dalam campuran PCR yang siap pakai, yang mengandung seluruh komponen yang diperlukan untuk reaksi penjabaran DNA. Perangkat ini telah dioptimisasi melalui usaha penelitian ekstensif oleh pabrik komersiil. Perangkat ini dibuat secara khusus sehingga pemakai tinggal menambahkan larutan dari perangkat ke dalam genom DNA dalam jumlah tertentu. Hasil terbaik dengan perangkat komersiil ini didapatkan jika cetakan DNA ditambahkan dalam jumlah yang cukup untuk berinteraksi dengan larutan dari perangkat tersebut.
